Protein production and analysis 3900-BT1-7
Tydzień 1 — Ekspresja, ekstrakcja i oczyszczanie
Przygotowanie ekstraktów i chromatografia powinowactwa. Dezintegracja komórek metodą sonikacji lub homogenizacji wysokociśnieniowej oraz wpływ wybranej metody na uwalnianie proteaz i obecność kwasów nukleinowych; klarowanie lizatu; podstawy chemiczne chromatografii powinowactwa do immobilizowanych jonów metali oraz projektowanie znaczników powinowactwa, w tym ich położenie, skład łącznika i enzymatyczne usuwanie znacznika. Porównanie oczyszczania tego samego lizatu na złożu Ni-NTA przy zastosowaniu trzech różnych stężeń imidazolu.
Oczyszczanie i SDS-PAGE (polimeraza RNA T7, wysokiej wierności polimeraza pochodząca z Pfu, Cas9). Dalsze oczyszczanie metodą chromatografii jonowymiennej lub powinowactwa do heparyny; zagęszczanie i wymiana buforu; przygotowanie tabeli oczyszczania. Porównanie systemów elektroforetycznych Laemmliego i Tricine oraz omówienie nietypowej migracji białek wiążących kwasy nukleinowe i ograniczeń oceny jednorodności preparatu na podstawie pojedynczego prążka.
Oczyszczanie kompleksu białkowego VCE. Porównanie koekspresji i wspólnej lizy w przypadku enzymu heterodimerycznego; kontrola stechiometrii; rozdzielenie prawidłowo złożonego kompleksu enzymu cappingowego D1–D12 od wolnej dużej podjednostki. Wprowadzenie do oznaczania masy i stechiometrii kompleksów białkowych.
Tydzień 2 — Weryfikacja aktywności
Aktywność polimerazy RNA T7 typu dzikiego i wariantu oraz aktywność VCE. Reakcje transkrypcji in vitro z ilościową oceną wydajności, prawidłowości transkrypcji oraz powstawania dwuniciowego RNA; wykrywanie dsRNA metodą dot-blot lub immunologiczną; ocena wydajności procesu cappingu. Powiązanie wyników z wymaganiami dotyczącymi wytwarzania terapeutycznego mRNA.
Aktywność Cas9, katalitycznie nieaktywnego Cas9 i/lub Cas13 in vitro. Tworzenie i miareczkowanie kompleksów rybonukleoproteinowych; analiza cięcia linearyzowanego plazmidu za pomocą elektroforezy agarozowej; zastosowanie katalitycznie nieaktywnego wariantu jako kontroli specyficzności; aktywność uboczna Cas13 jako przykład wykorzystania właściwości enzymatycznych w diagnostyce.
Aktywność wysokiej wierności polimerazy DNA pochodzącej z Pfu. Porównanie amplifikacji z enzymem pozbawionym aktywności korekcyjnej; pomiar częstości błędów metodą reporterową lub sekwencjonowania; wpływ fuzji z niespecyficzną domeną wiążącą DNA na procesywność enzymu.
Tydzień 3 — Identyfikacja, platformy produkcyjne i pierwszy blok analityczny
Spektrometria mas – wprowadzenie, przygotowanie próbek i trawienie trypsyną. Metody jonizacji i najczęściej stosowane analizatory mas; podstawy proteomiki typu bottom-up; redukcja, alkilacja i trawienie białek; porównanie metod przygotowania próbek oraz źródła zanieczyszczeń w próbkach o małej ilości materiału.
Systemy ekspresji w komórkach ssaczych; oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych; SDS-PAGE i/lub przygotowanie próbek do mikroskopii elektronowej. Ekspresja przejściowa i stabilna, linie HEK293 i CHO, glikozylacja jako krytyczny parametr jakości; oczyszczanie z wykorzystaniem białka A i dalszych etapów chromatograficznych; przygotowanie próbek przeciwciał do oceny agregacji i jednorodności metodą mikroskopii elektronowej.
Ultrawirowanie analityczne, DLS i SEC-MALS – demonstracja i prezentacja aparatury. Budowa aparatury, przygotowanie próbek i wymagania eksperymentalne. Analiza preparatów otrzymanych przez studentów w pierwszym tygodniu zajęć.
Tydzień 4 — Drugi blok analityczny i interpretacja wyników
Ultrawirowanie analityczne, DLS i SEC-MALS – analiza danych. Analiza rozkładu c(s) danych sedymentacyjnych; analiza funkcji autokorelacji i interpretacja wskaźnika polidyspersyjności DLS; wyznaczanie bezwzględnej masy molowej na podstawie pomiarów rozpraszania światła i stężenia oraz określanie stanu oligomerycznego kompleksu enzymu cappingowego.
Różnicowa kalorymetria skaningowa i mikrokalorymetria; dichroizm kołowy; FTIR; fotometria masowa. Wyznaczanie temperatury przejścia i entalpii kalorymetrycznej, ocena odwracalności procesu i modeli dwustanowych; porównanie DSC z wysokoprzepustowymi metodami fluorometrycznymi; określanie struktury drugorzędowej na podstawie widm CD; analiza pasma amidowego I metodą FTIR oraz zastosowanie tej techniki do próbek zagregowanych i błonowych; fotometria masowa jako metoda pomiaru rozkładu mas pojedynczych cząsteczek.
Analiza wyników spektrometrii mas. Przeszukiwanie baz danych, tolerancja masy prekursora i wpływ wielkości przestrzeni wyszukiwania; szacowanie współczynnika wyników fałszywie dodatnich (FDR) metodą target–decoy na poziomie dopasowania widmo–peptyd oraz białka; ilościowa analiza bez znakowania; identyfikacja białek zanieczyszczających obecnych w preparatach uzyskanych podczas oczyszczania oraz porównanie wyników z obrazem żelu barwionego Coomassie.
Koordynatorzy przedmiotu
Rodzaj przedmiotu
Tryb prowadzenia
Założenia (opisowo)
Efekty uczenia się
Wiedza – student zna i rozumie:
1. Podstawy rozdziału metodami chromatografii powinowactwa, jonowymiennej i wykluczania molekularnego oraz wpływ warunków buforowych na selektywność i pojemność chromatografii IMAC.
2. Zasady rozdziału metodą SDS-PAGE, przyczyny nietypowej migracji białek oraz ograniczenia wykorzystania barwionego żelu jako kryterium czystości preparatu.
3. Podstawy enzymologii badanych układów modelowych: rozpoznawanie promotora i procesywność polimerazy RNA T7, mechanizm działania domen nukleazowych HNH i RuvC białka Cas9 oraz jego inaktywacji, rozpoznawanie RNA i aktywność uboczną Cas13, aktywność korekcyjną polimeraz DNA z rodziny B oraz trzy reakcje katalizowane przez enzym cappingowy.
4. Różnice pomiędzy bakteryjnymi i ssaczymi systemami ekspresji pod względem wydajności, modyfikacji białek, kosztów i wymagań regulacyjnych oraz podstawowe etapy przemysłowego procesu wytwarzania przeciwciał monoklonalnych.
5. Parametry mierzone za pomocą poszczególnych metod analitycznych: współczynnik sedymentacji, promień hydrodynamiczny, masa molowa, entalpia i temperatura przejścia, eliptyczność, kształt pasma amidowego I oraz kontrast interferometryczny, a także założenia niezbędne do ich prawidłowej interpretacji.
6. Podstawy proteomiki typu bottom-up – od specyficzności trawienia proteolitycznego do kontroli współczynnika wyników fałszywie dodatnich (FDR) metodą target–decoy.
Umiejętności – student potrafi:
1. Przygotować klarowany ekstrakt oraz przeprowadzić dwuetapowe oczyszczanie białka, dokumentując wydajność i aktywność właściwą w tabeli oczyszczania.
2. Przeprowadzić i zinterpretować elektroforezę SDS-PAGE oraz oszacować czystość i stechiometrię preparatu za pomocą analizy densytometrycznej.
3. Zaprojektować i przeprowadzić ilościowy test aktywności in vitro z zastosowaniem odpowiednich kontroli negatywnych.
4. Przygotować próbkę do analizy LC-MS/MS oraz krytycznie ocenić wyniki przeszukiwania baz danych.
5. Uzyskać i analizować dane AUC, DLS, SEC-MALS, DSC, CD i FTIR dla tego samego zestawu próbek oraz zintegrować wyniki w spójny opis właściwości badanego preparatu.
6. Przedstawić przeprowadzone doświadczenia w sposób umożliwiający ich odtworzenie, w formie opisu metod oraz odpowiednio przygotowanego zestawu wyników i rycin.
Kompetencje społeczne – student jest gotów do:
1. Współpracy z innymi osobami podczas pracy laboratoryjnej oraz merytorycznego przedstawiania i uzasadniania interpretacji uzyskanych danych.
2. Krytycznej oceny ograniczeń wynikających z zastosowania pojedynczej metody badawczej oraz poszukiwania potwierdzenia uzyskanych wyników za pomocą niezależnych, komplementarnych metod.
Kryteria oceniania
Forma zaliczenia: przygotowanie i prezentacja projektu.
Każdy zespół pracuje przez cały okres realizacji przedmiotu nad jednym preparatem białkowym – od lizatu otrzymanego w pierwszym tygodniu do jego końcowej charakterystyki biofizycznej w tygodniu czwartym. Wyniki przedstawiane są jako jeden spójny projekt, a nie jako podsumowanie czterech odrębnych ćwiczeń. Projekt dotyczy jednego preparatu analizowanego za pomocą wszystkich zastosowanych metod.
Podstawowym wymaganiem jest uzyskanie spójnego obrazu badanego preparatu. Stan oligomeryczny określony metodą SEC-MALS powinien być zgodny z wynikami ultrawirowania analitycznego i fotometrii masowej; ocena czystości na podstawie elektroforezy powinna być odniesiona do wyników spektrometrii mas, a aktywność właściwa przedstawiona w kontekście całego procesu oczyszczania.
W przypadku rozbieżności pomiędzy wynikami uzyskanymi różnymi metodami należy je wskazać, przeanalizować oraz uzasadnić, które wyniki można uznać za najbardziej wiarygodne i dlaczego.
Projekt pisemny powinien zawierać:
opis metod umożliwiający odtworzenie przeprowadzonych doświadczeń,
tabelę oczyszczania zawierającą wydajność i aktywność właściwą na poszczególnych etapach,
opisany zestaw rycin i wyników, w tym żele, wyniki testów aktywności wraz z kontrolami oraz pozostałe uzyskane dane,
zintegrowaną analizę i charakterystykę badanego preparatu,
podpisane przez oboje członków zespołu oświadczenie określające indywidualny wkład w realizację projektu.
Projekt wraz z surowymi danymi i plikami zawierającymi wyniki analiz należy złożyć na tydzień przed ostatnimi zajęciami.
Prezentacja projektu: podczas ostatnich zajęć każdy zespół przedstawia 20-minutową prezentację, po której przewidziano 10 minut na pytania i dyskusję. W prezentacji uczestniczą oboje członkowie zespołu. Każdy zespół pełni również rolę dyskutanta projektu innego zespołu i przygotowuje wcześniej dwa merytoryczne pytania.
Dopuszczalne są maksymalnie dwie nieobecności. W przypadku wieloetapowych eksperymentów prowadzonych w parach, do kontynuowania pracy wymagana jest obecność co najmniej jednej osoby z zespołu.
Literatura
1. Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 1975;258:598–599. doi: 10.1038/258598a0.
2. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 2003;60:523–533. doi: 10.1007/s00253-002-1158-6.
3. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227:680–685. doi: 10.1038/227680a0.
4. Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172. doi: 10.3389/fmicb.2014.00172.
5. Schägger H. Tricine–SDS-PAGE. Nat Protoc. 2006;1:16–22. doi: 10.1038/nprot.2006.4.
6. Ramanathan A, Robb GB, Chan S-H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res. 2016;44:7511–7526. doi: 10.1093/nar/gkw551.
7. Shuman S. Structure, mechanism, and evolution of the mRNA capping apparatus. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 2000;66:1–40. doi: 10.1016/S0079-6603(00)66025-7.
8. Håkansson K, Doherty AJ, Shuman S, Wigley DB. X-ray crystallography reveals a large conformational change during guanyl transfer by mRNA capping enzymes. Cell. 1997;89:545–553. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80236-6.
9. Studier FW, Moffatt BA. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 1986;189:113–130. doi: 10.1016/0022-2836(86)90385-2.
10. Milligan JF, Groebe DR, Witherell GW, Uhlenbeck OC. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res. 1987;15:8783–8798. doi: 10.1093/nar/15.21.8783.
11. Karikó K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Res. 2011. doi: 10.1093/nar/gkr695; Mu X, Greenwald E, Ahmad S, Hur S. An origin of the immunogenicity of in vitro transcribed RNA. Nucleic Acids Res. 2018;46:5239–5249. doi: 10.1093/nar/gky177.
12. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vaccines — a new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov. 2018;17:261–279. doi: 10.1038/nrd.2017.243.
13. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337:816–821. doi: 10.1126/science.1225829.
14. Jiang F, Doudna JA. CRISPR–Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 2017;46:505–529. doi: 10.1146/annurev-biophys-062215-010822.
15. Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013;152:1173–1183. doi: 10.1016/j.cell.2013.02.022.
16. Cline J, Braman JC, Hogrefe HH. PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1996;24:3546–3551. doi: 10.1093/nar/24.18.3546.
17. Wang Y, Prosen DE, Mei L, Sullivan JC, Finney M, Vander Horn PB. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Res. 2004;32:1197–1207. doi: 10.1093/nar/gkh271.
18. Aebersold R, Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 2003;422:198–207. doi: 10.1038/nature01511.
19. Aebersold R, Mann M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 2016;537:347–355. doi: 10.1038/nature19949.
20. Wurm FM. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 2004;22:1393–1398. doi: 10.1038/nbt1026.
21. Shukla AA, Hubbard B, Tressel T, Guhan S, Low D. Downstream processing of monoclonal antibodies — application of platform approaches. J Chromatogr B. 2007;848:28–39. doi: 10.1016/j.jchromb.2006.09.026.
22. Hober S, Nord K, Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification. J Chromatogr B. 2007;848:40–47. doi: 10.1016/j.jchromb.2006.09.030.
23. Liu HF, Ma J, Winter C, Bayer R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. mAbs. 2010;2:480–499. doi: 10.4161/mabs.2.5.12645.
24. Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys J. 2000;78:1606–1619. doi: 10.1016/S0006-3495(00)76713-0.
25. Lebowitz J, Lewis MS, Schuck P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 2002;11:2067–2079. doi: 10.1110/ps.0207702.
26. Stetefeld J, McKenna SA, Patel TR. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophys Rev. 2016;8:409–427. doi: 10.1007/s12551-016-0218-6.
27. Sahin E, Roberts CJ. Size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering for elucidating protein aggregation mechanisms. Methods Mol Biol. 2012;899:403–423. doi: 10.1007/978-1-61779-921-1_25.
28. Privalov PL, Potekhin SA. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 1986;131:4–51. doi: 10.1016/0076-6879(86)31033-4.
29. Johnson CM. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch Biochem Biophys. 2013;531:100–109. doi: 10.1016/j.abb.2012.09.008.
30. Jelesarov I, Bosshard HR. Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition. J Mol Recognit. 1999;12:3–18. doi: 10.1002/(SICI)1099-1352(199901/02)12:1<3::AID-JMR441>3.0.CO;2-6.
31. Niesen FH, Berglund H, Vedadi M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2007;2:2212–2221. doi: 10.1038/nprot.2007.321.
32. Young G, Hundt N, Cole D, et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 2018;360:423–427. doi: 10.1126/science.aar5839.
33. Sonn-Segev A, Belacic K, Bodrug T, et al. Quantifying the heterogeneity of macromolecular machines by mass photometry. Nat Commun. 2020;11:1772. doi: 10.1038/s41467-020-15642-w.
34. Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 2008;26:1367–1372. doi: 10.1038/nbt.1511.
35. Tyanova S, Temu T, Sinitcyn P, Carlson A, Hein MY, Geiger T, Mann M, Cox J. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods. 2016;13:731–740. doi: 10.1038/nmeth.3901.
36. Elias JE, Gygi SP. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat Methods. 2007;4:207–214. doi: 10.1038/nmeth1019.
37. Cox J, Hein MY, Luber CA, Paron I, Nagaraj N, Mann M. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.