Chemistry of RNA and peptides (from block synthesis to therapeutic applications). 3900-BT1-2
Dwie klasy cząsteczek, które jeszcze stosunkowo niedawno uznawano za niemożliwe do skutecznego wykorzystania farmakologicznego, stanowią obecnie istotną część nowo zatwierdzanych leków. Oligonukleotydy antysensowne, małe interferujące RNA (siRNA), szczepionki mRNA oraz rosnąca grupa makrocyklicznych i modyfikowanych peptydów znalazły zastosowanie kliniczne dzięki rozwiązaniu konkretnych problemów chemicznych, takich jak odporność na nukleazy, rozpoznawanie przez układ odporności wrodzonej, powinowactwo do celu molekularnego, przepuszczalność przez błony, możliwość prowadzenia syntezy w dużej skali oraz dystrybucja tkankowa. Głównym założeniem przedmiotu jest pokazanie, że są to problemy natury chemicznej, ich rozwiązania można rozpoznać w strukturach zatwierdzonych leków, a znajomość chemii pozwala przewidywać właściwości tych cząsteczek.
Przedmiot składa się z dwóch równoległych części o podobnej strukturze wewnętrznej, co umożliwia studentom systematyczne porównywanie RNA i peptydów.
Wykłady 1–6 – RNA i oligonukleotydy
Punktem wyjścia jest założenie, że funkcja RNA wynika nie tylko z jego sekwencji, lecz również ze struktury i dynamiki strukturalnej. Z tego względu RNA jest zarówno wymagającym celem dla leków, jak i obiecującą platformą terapeutyczną. Dwa kolejne wykłady dotyczą modyfikacji chemicznych: najpierw epitranskryptomu, w którym modyfikacje wprowadzane przez enzymy komórkowe stanowią dodatkowy poziom regulacji, a następnie modyfikacji tRNA i rRNA oraz ich znaczenia immunologicznego, które umożliwiło terapeutyczne wykorzystanie modyfikowanego mRNA.
Od wykładu 4 nacisk zostaje położony na syntezę. Omawiane są właściwości chemiczne szkieletu i cukru kwasów nukleinowych oraz oparte na nich analogi, takie jak fosforotioaty, modyfikacje 2′-O-metylowe i 2′-MOE, LNA i BNA, morfolinowe analogi oligonukleotydów oraz peptydowe kwasy nukleinowe (PNA). Każda modyfikacja analizowana jest pod kątem jej zalet i ograniczeń. Wykłady 5 i 6 przedstawiają sposoby syntezy tych cząsteczek – od chemii fosforoamidytów i cyklu syntezy po strategie stosowania grup ochronnych dla grupy 2′-hydroksylowej oraz wpływ wydajności kolejnych etapów sprzęgania na maksymalną osiągalną długość produktu. Omawiane są również metody oczyszczania i charakterystyki, chemia kapu mRNA, procesy produkcyjne oraz aspekty środowiskowe związane z produkcją w skali przemysłowej.
Wykłady 7–10 – peptydy i białka
Wykład 7 obejmuje chemię aminokwasów, konformacyjne podstawy struktur drugo- i trzeciorzędowych oraz wewnętrzne nieuporządkowanie jako funkcjonalny stan białka, a nie brak zdolności do prawidłowego fałdowania.
Wykłady 8 i 9 dotyczą modyfikacji w układzie analogicznym do części poświęconej RNA. W pierwszej kolejności omawiane są biologiczne modyfikacje potranslacyjne, ich chemia oraz znaczenie funkcjonalne, a następnie syntetyczne modyfikacje stosowane w celu uzyskania pożądanych właściwości farmakologicznych. Obejmują one makrocyklizację, stabilizację peptydów typu „stapling”, peptydomimetyki, foldamery, lipidację, PEGylację oraz strategie wydłużania okresu półtrwania.
Wykład 10 dotyczy syntezy i funkcjonalizacji: syntezy peptydów na fazie stałej metodami Fmoc i Boc, natywnej i ekspresyjnej ligacji białek, chemoselektywnej biokoniugacji oraz rozszerzania kodu genetycznego jako sposobu uzyskiwania modyfikacji białek w ściśle określonych miejscach, szczególnie w przypadku białek zbyt dużych do syntezy chemicznej.
Wykłady 11–12 – integracja i zastosowania kliniczne
Wykład oparty na analizie przypadków rozpoczyna się od właściwości zatwierdzonych leków, a następnie prowadzi do wyjaśniających je rozwiązań chemicznych. Omawiane są m.in. oligonukleotydy antysensowne, takie jak nusinersen, inotersen i tofersen, leki siRNA wykorzystujące koniugaty GalNAc oraz szczepionki mRNA przeciw SARS-CoV-2. W części dotyczącej peptydów analizowane są agoniści receptora GLP-1, w przypadku których lipidacja i wiązanie z albuminą pozwalają przekształcić peptyd o okresie półtrwania wynoszącym około dwóch minut w lek podawany raz w tygodniu.
Ostatni wykład dotyczy nierozwiązanych problemów i przyszłych kierunków rozwoju. W przypadku oligonukleotydów głównym wyzwaniem pozostaje skuteczne dostarczanie do tkanek innych niż wątroba, natomiast w przypadku peptydów – biodostępność po podaniu doustnym. Omawiane są chemia nanocząstek lipidowych, ukierunkowane dostarczanie z wykorzystaniem koniugatów, edycja zasad i prime editing jako strategie terapeutyczne, a także zagadnienia związane z produkcją i kosztami, które wpływają na możliwość wprowadzenia nowych terapii do praktyki klinicznej.
Ocena osiągnięć studenta
Sposób oceny koncentruje się na kluczowej umiejętności rozwijanej podczas przedmiotu, a nie na odtwarzaniu zapamiętanych informacji. W ramach egzaminu studenci analizują nieznane wcześniej struktury chemiczne.
Koordynatorzy przedmiotu
Rodzaj przedmiotu
Tryb prowadzenia
Założenia (opisowo)
Efekty uczenia się
Wiedza – student zna i rozumie:
1. Zależność między strukturą drugo- i trzeciorzędową RNA, jego dynamiką a funkcją oraz wynikające z niej uwarunkowania wykorzystania RNA jako celu molekularnego i platformy terapeutycznej.
2. Główne modyfikacje chemiczne RNA, z rozróżnieniem modyfikacji wprowadzanych enzymatycznie w celach regulacyjnych oraz syntetycznie w celach farmakologicznych.
3. Właściwości chemiczne szkieletu fosfodiestrowego i rybozy oraz wpływ poszczególnych klas analogów na stabilność wobec nukleaz, powinowactwo do komplementarnej nici, aktywność RNazy H, wiązanie z białkami i immunogenność.
4. Cykl syntezy fosforoamidytowej, strategie stosowania grup ochronnych oraz zależność między wydajnością kolejnych etapów sprzęgania a maksymalną praktyczną długością oligonukleotydu.
5. Konformacyjne podstawy struktury polipeptydów, w tym wewnętrzne nieuporządkowanie, oraz zależność między właściwościami chemicznymi łańcuchów bocznych aminokwasów a ich reaktywnością i miejscami modyfikacji.
6. Najważniejsze modyfikacje potranslacyjne, ich podstawy chemiczne oraz strategie syntetycznej modyfikacji peptydów w celu zwiększenia ich stabilności, przepuszczalności i powinowactwa.
7. Zasady syntezy peptydów na fazie stałej, ligacji chemicznej, biokoniugacji i rozszerzania kodu genetycznego oraz kryteria doboru odpowiedniej metody do określonego celu.
8. Znaczenie modyfikacji chemicznych stosowanych w zatwierdzonych lekach opartych na RNA lub peptydach oraz ich wpływ na właściwości kliniczne tych leków.
Umiejętności – student potrafi:
1. Analizować nieznaną wcześniej strukturę oligonukleotydu lub peptydu oraz na jej podstawie przewidywać jego stabilność, mechanizm działania i prawdopodobną dystrybucję tkankową.
2. Zaproponować drogę syntezy określonego modyfikowanego oligonukleotydu lub peptydu oraz wskazać główne trudności związane z jej realizacją.
3. Uzasadnić wybór określonej modyfikacji chemicznej w odniesieniu do założonego celu terapeutycznego oraz wskazać związane z tym ograniczenia i koszty.
4. Wyszukiwać i analizować pierwotną literaturę naukową dotyczącą określonego leku lub klasy modyfikacji oraz rozróżniać wnioski oparte na mechanizmie działania od zależności korelacyjnych.
Kompetencje społeczne – student jest gotów do:
1. Krytycznej analizy klinicznych i ekonomicznych konsekwencji decyzji podejmowanych podczas projektowania chemicznego leków, w tym kosztów ich wytwarzania i dostępności terapii.
2. Rozpoznawania ograniczeń związanych z uogólnianiem właściwości danej platformy terapeutycznej oraz unikania przenoszenia wniosków dotyczących pojedynczego skutecznego leku na całą klasę związków.
Kryteria oceniania
Egzamin ma formę testu wielokrotnego wyboru obejmującego materiał przedstawiony podczas wykładów. Trwa maksymalnie 90 minut i składa się z maksymalnie 30 pytań lub zadań, ocenianych indywidualnie, za które można uzyskać łącznie maksymalnie 100 punktów.
Ocena końcowa ustalana jest na podstawie procentu punktów uzyskanych w stosunku do maksymalnej liczby punktów:
do 50% – 2,0 (niedostateczny),
51–60% – 3,0 (dostateczny),
61–70% – 3,5 (dostateczny plus),
71–80% – 4,0 (dobry),
81–90% – 4,5 (dobry plus),
91–100% – 5,0 (bardzo dobry).
Do zaliczenia przedmiotu wymagane jest uzyskanie co najmniej 51% maksymalnej liczby punktów. Dopuszczalne są maksymalnie 2 nieobecności.
Literatura
Wykład 1. Przegląd struktury i funkcji RNA
1. Ganser LR, Kelly ML, Herschlag D, Al-Hashimi HM (2019) The roles of structural dynamics in the cellular functions of RNAs. *Nat Rev Mol Cell Biol* 20:474–489. doi:10.1038/s41580-019-0136-0.
2. Cech TR, Steitz JA (2014) The Noncoding RNA Revolution—Trashing Old Rules to Forge New Ones. *Cell* 157:77–94. doi:10.1016/j.cell.2014.03.008.
3. Breaker RR (2010) Riboswitches and the RNA World. *Cold Spring Harb Perspect Biol* 4:a003566. doi:10.1101/cshperspect.a003566.
Wykłady 2 i 3. Znaczenie modyfikacji chemicznych
4. Roundtree IA, Evans ME, Pan T, He C (2017) Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. *Cell* 169:1187–1200. doi:10.1016/j.cell.2017.05.045.
5. Dominissini D, Moshitch-Moshkovitz S, Schwartz S, et al. (2012) Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. *Nature* 485:201–206. doi:10.1038/nature11112.
6. Wang X, Lu Z, Gomez A, et al. (2013) N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. *Nature* 505:117–120. doi:10.1038/nature12730.
7. Suzuki T (2021) The expanding world of tRNA modifications and their disease relevance. *Nat Rev Mol Cell Biol* 22:375–392. doi:10.1038/s41580-021-00342-0.
8. Karikó K, Buckstein M, Ni H, Weissman D (2005) Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The Impact of Nucleoside Modification and the Evolutionary Origin of RNA. *Immunity* 23:165–175. doi:10.1016/j.immuni.2005.06.008.
9. Wiener D, Schwartz S (2020) The epitranscriptome beyond m6A. *Nat Rev Genet* 22:119–131. doi:10.1038/s41576-020-00295-8.
Wykład 4. Właściwości chemiczne polimerów kwasów nukleinowych i ich analogów
10. Wan WB, Seth PP (2016) The Medicinal Chemistry of Therapeutic Oligonucleotides. *J Med Chem* 59:9645–9667. doi:10.1021/acs.jmedchem.6b00551.
11. Khvorova A, Watts JK (2017) The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. *Nat Biotechnol* 35:238–248. doi:10.1038/nbt.3765.
12. Vester B, Wengel J (2004) LNA (Locked Nucleic Acid): High-Affinity Targeting of Complementary RNA and DNA. *Biochemistry* 43:13233–13241. doi:10.1021/bi0485732.
13. Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (1991) Sequence-Selective Recognition of DNA by Strand Displacement with a Thymine-Substituted Polyamide. *Science* 254:1497–1500. doi:10.1126/science.1962210.
Wykłady 5 i 6. Synteza nukleozydów, nukleotydów, oligonukleotydów i ich analogów
14. Beaucage SL, Caruthers MH (1981) Deoxynucleoside phosphoramidites—A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. *Tetrahedron Lett* 22:1859–1862. doi:10.1016/S0040-4039(01)90461-7.
15. Caruthers MH (2013) The Chemical Synthesis of DNA/RNA: Our Gift to Science. *J Biol Chem* 288:1420–1427. doi:10.1074/jbc.X112.442855.
16. De Clercq E, Holý A (2005) Acyclic nucleoside phosphonates: a key class of antiviral drugs. *Nat Rev Drug Discov* 4:928–940. doi:10.1038/nrd1877.
17. Obexer R, Nassir M, Moody ER, et al. (2024) Modern approaches to therapeutic oligonucleotide manufacturing. *Science* 384. doi:10.1126/science.adl4015.
18. Ramanathan A, Robb GB, Chan SH (2016) mRNA capping: biological functions and applications. *Nucleic Acids Res* 44:7511–7526. doi:10.1093/nar/gkw551.
19. Roberts TC, Langer R, Wood MJA (2020) Advances in oligonucleotide drug delivery. *Nat Rev Drug Discov* 19:673–694. doi:10.1038/s41573-020-0075-7.
Wykład 7. Przegląd struktury i funkcji aminokwasów oraz polipeptydów
20. Richardson JS (1981) The Anatomy and Taxonomy of Protein Structure. *Adv Protein Chem* 34:167–339. doi:10.1016/S0065-3233(08)60520-3.
21. Kabsch W, Sander C (1983) Dictionary of protein secondary structure: Pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. *Biopolymers* 22:2577–2637. doi:10.1002/bip.360221211.
22. Wright PE, Dyson HJ (2014) Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. *Nat Rev Mol Cell Biol* 16:18–29. doi:10.1038/nrm3920.
Wykłady 8 i 9. Modyfikacje peptydów
23. Walsh CT, Garneau-Tsodikova S, Gatto GJ (2005) Protein Posttranslational Modifications: The Chemistry of Proteome Diversifications. *Angew Chem Int Ed* 44:7342–7372. doi:10.1002/anie.200501023.
24. Moremen KW, Tiemeyer M, Nairn AV (2012) Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. *Nat Rev Mol Cell Biol* 13:448–462. doi:10.1038/nrm3383.
25. Kerscher O, Felberbaum R, Hochstrasser M (2006) Modification of Proteins by Ubiquitin and Ubiquitin-Like Proteins. *Annu Rev Cell Dev Biol* 22:159–180. doi:10.1146/annurev.cellbio.22.010605.093503.
26. White CJ, Yudin AK (2011) Contemporary strategies for peptide macrocyclization. *Nat Chem* 3:509–524. doi:10.1038/nchem.1062.
27. Walensky LD, Bird GH (2014) Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. *J Med Chem* 57:6275–6288. doi:10.1021/jm4011675.
28. Driggers EM, Hale SP, Lee J, Terrett NK (2008) The exploration of macrocycles for drug discovery — an underexploited structural class. *Nat Rev Drug Discov* 7:608–624. doi:10.1038/nrd2590.
29. Hill DJ, Mio MJ, Prince RB, et al. (2001) A Field Guide to Foldamers. *Chem Rev* 101:3893–4012. doi:10.1021/cr990120t.
Wykład 10. Metody syntezy i funkcjonalizacji peptydów, białek i koniugatów
30. Merrifield RB (1963) Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. *J Am Chem Soc* 85:2149–2154. doi:10.1021/ja00897a025.
31. Dawson PE, Muir TW, Clark-Lewis I, Kent SBH (1994) Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. *Science* 266:776–779. doi:10.1126/science.7973629.
32. Boutureira O, Bernardes GJL (2015) Advances in Chemical Protein Modification. *Chem Rev* 115:2174–2195. doi:10.1021/cr500399p.
33. Chin JW (2017) Expanding and reprogramming the genetic code. *Nature* 550:53–60. doi:10.1038/nature24031.
34. Behrendt R, White P, Offer J (2016) Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis. *J Pept Sci* 22:4–27. doi:10.1002/psc.2836.
Wykład 11. Analiza przypadków: zatwierdzone leki oparte na RNA i peptydach
35. Crooke ST, Baker BF, Crooke RM, Liang XH (2021) Antisense technology: an overview and prospectus. *Nat Rev Drug Discov* 20:427–453. doi:10.1038/s41573-021-00162-z.
36. Setten RL, Rossi JJ, Han SP (2019) The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. *Nat Rev Drug Discov* 18:421–446. doi:10.1038/s41573-019-0017-4.
37. Muttenthaler M, King GF, Adams DJ, Alewood PF (2021) Trends in peptide drug discovery. *Nat Rev Drug Discov* 20:309–325. doi:10.1038/s41573-020-00135-8.
38. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D (2018) mRNA vaccines — a new era in vaccinology. *Nat Rev Drug Discov* 17:261–279. doi:10.1038/nrd.2017.243.
39. Adams D, Gonzalez-Duarte A, O’Riordan WD, et al. (2018) Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. *N Engl J Med* 379:11–21. doi:10.1056/NEJMoa1716153.
Wykład 12. Nowe kierunki rozwoju i wyzwania
40. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, et al. (2021) The current landscape of nucleic acid therapeutics. *Nat Nanotechnol* 16:630–643. doi:10.1038/s41565-021-00898-0.
41. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y (2021) Lipid nanoparticles for mRNA delivery. *Nat Rev Mater* 6:1078–1094. doi:10.1038/s41578-021-00358-0.
42. Anzalone AV, Koblan LW, Liu DR (2020) Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. *Nat Biotechnol* 38:824–844. doi:10.1038/s41587-020-0561-9.
43. Chaudhary N, Weissman D, Whitehead KA (2021) mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. *Nat Rev Drug Discov* 20:817–838. doi:10.1038/s41573-021-00283-5.