General Biology of RNA and Proteins 3900-BT1-1
Wykład 1 — Wprowadzenie do chemii i dynamiki strukturalnej RNA
Chemia nukleotydów: reaktywność grupy 2′-OH, hydroliza wiązań fosfodiestrowych, tautomeria i protonowanie, koordynacja jonów metali. Hierarchia struktur drugo- i trzeciorzędowych: helisy, pętle, wybrzuszenia, pseudowęzły, motywy A-minor, pętle typu kissing loop, G-kwadrupleksy. Termodynamika i kinetyka fałdowania; pułapki nieprawidłowego fałdowania i fałdowanie wspomagane przez białka opiekuńcze. Zespoły konformacyjne: stany wzbudzone, przejściowe pary zasad, zmiany konformacyjne indukowane przez ligandy i ryboprzełączniki. Przegląd metod: dyspersja relaksacji NMR, SAXS, cryo-EM, sondowanie chemiczne SHAPE/DMS i mapowanie struktury w skali transkryptomu, smFRET.
Wykład 2 — Chemia kapu mRNA
Kotranskrypcyjne tworzenie kapu: trifosfataza RNA, guanylylotransferaza i N7-metylotransferaza; kap m7G oraz kap1 i kap2 z metylacją 2′-O. Białka wiążące kap – CBC (CBP20/80) w jądrze oraz eIF4E podczas inicjacji translacji – i funkcja kapu jako znacznika „własnego” RNA. Kontrola jakości zależna od kapu: usuwanie kapu (DCP2, DXO, Nudt16), niekanoniczne kapy (NAD⁺, FAD, dpCoA), kontrola końca 5′. Naśladowanie kapu i „cap snatching” przez wirusy; analogi kapu (ARCA, struktury typu CleanCap) oraz ich zastosowanie w produkcji szczepionek mRNA i ograniczaniu aktywacji odporności wrodzonej.
Wykład 3 — Cykl życia RNA: stabilność i degradacja
Czynniki determinujące okres półtrwania mRNA: elementy 3′UTR (ARE, CDE), optymalność kodonów, długość ogona poli(A) i deadenylacja przez PAN2–PAN3 oraz CCR4–NOT. Usuwanie kapu i degradacja 5′→3′ przez XRN1; degradacja 3′→5′ przez egzosom i kompleks SKI. Szlaki endonukleolityczne: RNase L, SMG6, Regnase/Roquin. Degradacja kotranslacyjna i szlaki nadzoru jakości: NMD, no-go decay i non-stop decay. Przedziały powstające w wyniku separacji fazowej – P-bodies i ziarnistości stresowe – jako potencjalne przyczyny lub skutki represji. Metody pomiaru degradacji: znakowanie metaboliczne (SLAM-seq, TT-seq), zahamowanie transkrypcji, profilowanie nowo syntetyzowanych łańcuchów.
Wykład 4 — Epitranskryptomika: edycja RNA i modyfikacje chemiczne
Spektrum modyfikacji RNA: m6A, m5C, hm5C, ac4C, pseudourydyna, metylacja 2′-O, m1A i inozyna. Enzymy i białka odpowiedzialne za wprowadzanie, usuwanie i rozpoznawanie modyfikacji („writers”, „erasers”, „readers”) – METTL3/METTL14/WTAP, FTO i ALKBH5 oraz białka z domeną YTH – a także zagadnienie odwracalności modyfikacji. Wpływ na splicing, eksport, translację, degradację i zachowanie fazowe RNA. Edycja A→I przez ADAR1/ADAR2: rekodowanie oraz rozróżnianie „własnego” i „obcego” RNA, związek z interferonem. Edycja C→U przez APOBEC. Metody detekcji i ich ograniczenia: mapowanie z wykorzystaniem przeciwciał, chemiczne i enzymatyczne metody analizy pojedynczych nukleotydów (GLORI, bisulfite, RBS-seq), bezpośrednie sekwencjonowanie nanopore; stechiometria modyfikacji a katalogowanie miejsc ich występowania.
Wykład 5 — Struktura i biogeneza białek
Od sekwencji do struktury: hierarchia strukturalna, krajobrazy energetyczne, lejki fałdowania oraz różnice między problemem fałdowania białek a problemem przewidywania ich struktury. Fałdowanie kotranslacyjne, białka opiekuńcze związane z rybosomem (trigger factor, Hsp70/Hsp40), chaperoniny (GroEL, TRiC/CCT), białka zależne od Hsp90. Sieć proteostazy i kontrola jakości: UPR, odpowiedź na szok cieplny, agregacja i amyloid. Regiony wewnętrznie nieuporządkowane, domeny o niskiej złożoności i tworzenie kondensatów. Metody określania i przewidywania struktury: krystalografia rentgenowska, cryo-EM, NMR, modele klasy AlphaFold – wskaźniki ufności, ograniczenia i właściwe zastosowanie.
Wykład 6 — Sortowanie i eksport białek
Sekwencje sygnałowe i mechanizmy decydujące o sortowaniu białek. Ko- i potranslacyjne kierowanie białek do ER: SRP, translokon Sec61, SecA/SecYEG u bakterii; wbudowywanie białek błonowych (YidC/EMC, szlak GET). N-glikozylacja, tworzenie mostków disiarczkowych, ERAD oraz cykl kalneksyny/kalretikuliny. Transport pęcherzykowy: tworzenie pęcherzyków COPII i selekcja ładunku, transport zwrotny COPI, dojrzewanie aparatu Golgiego, sortowanie zależne od klatryny i adaptorów, dokowanie oraz fuzja zależna od SNARE. Alternatywne szlaki: import mitochondrialny i peroksysomalny, transport jądrowy, niekonwencjonalna sekrecja i pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Bakteryjne systemy sekrecji i ich wykorzystywanie przez patogeny.
Wykład 7 — Regulacja stabilności białek w komórkach i in vivo
System ubikwityny: organizacja E1–E2–E3, rodzaje wiązań w łańcuchach ubikwityny i kod ubikwitynowy; deubikwitynazy; modyfikatory UBL (SUMO, NEDD8). Proteasom 26S: rozpoznawanie substratów, rozwijanie białek, procesywność, degrony oraz szlaki N- i C-degronów. Autofagia i degradacja lizosomalna; receptory autofagii selektywnej. Pomiar stabilności białek: pulse-chase, proteomika obrotu białek SILAC, reportery GPS/degron, tandemowe timery fluorescencyjne oraz pomiary okresu półtrwania in vivo. Indukowana degradacja jako metoda terapeutyczna i narzędzie badawcze: PROTAC, molecular glues oraz warunkowe systemy degronów auxin/dTAG.
Wykład 8 — Lokalizacja, transport i dynamika subkomórkowa mRNA
Znaczenie lokalizacji mRNA: zwiększenie efektywności, polaryzacja komórki, lokalna kontrola proteomu i zapobieganie aktywności w niewłaściwych obszarach komórki. Sekwencje lokalizacyjne („zipcodes”) i czynniki działające w trans; transport zależny od motorów molekularnych wzdłuż mikrotubul i aktyny; kotwiczenie i lokalna aktywacja translacji; mechanizmy dyfuzji i wychwytywania oraz transportu kierunkowego; transport związany z organellami. Modele badawcze: Drosophila oskar/bicoid/gurken, ASH1 drożdży pączkujących, dendryty i aksony neuronów, migrujące fibroblasty oraz powierzchnie mitochondriów i ER. Obrazowanie i mapowanie: znakowanie MS2/PP7, single-molecule FISH, HCR, MERFISH/seqFISH, transkryptomika subkomórkowa oparta na APEX i metodach sąsiedztwa oraz obrazowanie translacji w żywych komórkach (SunTag).
Wykład 9 — Białka wiążące RNA
Klasyczna architektura domen wiążących RNA (RRM, KH, dsRBD, palec cynkowy, PUF, Pumilio, cold-shock) oraz niekonwencjonalne i wielofunkcyjne białka wiążące RNA; koncepcja „enigmatic RBP”; wiązanie RNA przez enzymy metaboliczne; hipoteza ryboregulacji. Metody identyfikacji w skali systemowej: RNA interactome capture, OOPS/XRNAX, RBDmap, metody z rodziny CLIP (HITS-CLIP, PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP), ich kontrole i artefakty. Specyficzność względem sekwencji i struktury; wielowartościowość oddziaływań, kondensaty i RNA jako rusztowanie molekularne. RBP w chorobach: TDP-43, FUS, SMN, MSI2 i ekspansje powtórzeń.
Wykład 10 — Interakcje gospodarz–patogen w kontekście RNA
RNA jako sygnał obecności patogenu: RIG-I, MDA5, LGP2, PKR, OAS/RNase L, TLR3/7/8 – chemiczne podstawy rozróżniania „własnego” i „obcego” RNA (5′-ppp, długość dupleksu, metylacja 2′-O, status modyfikacji). Indukcja interferonu i repertuar efektorów ISG (IFIT, ZAP, APOBEC3 oraz paradoksalna rola ADAR1). Mechanizmy obronne wirusów: naśladowanie kapu, cząsteczki wabikowe, metylacja, białka VSR, unikanie nukleaz, przejmowanie białek RBP gospodarza oraz przeciwdziałanie tworzeniu ziarnistości stresowych. Koronawirusy jako przykład: kompleksy replikacyjno-transkrypcyjne, synteza sgRNA i hamowanie ekspresji genów gospodarza przez nsp1. Regulacja zależna od sRNA u bakterii i pasożytów oraz komunikacja gospodarz–mikroorganizm oparta na RNA.
Wykład 11 — Peptydy i białka jako immunomodulatory
Peptydy obronne/antydrobnoustrojowe gospodarza: defensyny, katelicydyny (LL-37), klasy strukturalne, mechanizmy selektywnego oddziaływania z błonami oraz aktywność immunomodulacyjna niezwiązana bezpośrednio z działaniem przeciwdrobnoustrojowym – chemotaksja, gojenie ran i osłabianie odpowiedzi TLR. Cytokiny i ich modyfikowane warianty; peptydy modulujące punkty kontrolne odpowiedzi immunologicznej; szczepionki peptydowe i projektowanie epitopów; prezentacja MHC w kontekście chemii peptydów. Rozwój leków peptydowych: stabilność proteolityczna, cyklizacja, D-aminokwasy i peptydomimetyki, stabilizacja typu „stapling”, PEGylacja i lipidacja, dostarczanie oraz ograniczenia związane z immunogennością i selektywnością. Regulacyjne i translacyjne aspekty terapii peptydowych.
Wykład 12 — Badania nad RNA i białkami: perspektywy i kierunki rozwoju
Przyszłe kierunki rozwoju: programowalne leki oparte na RNA (szczepionki mRNA, samoreplikujące RNA, koliste RNA, ASO, siRNA, edycja RNA i CRISPR–Cas13); projektowanie RNA i białek z wykorzystaniem głębokiego uczenia oraz ocena jakości modeli; biologia strukturalna pojedynczych cząsteczek i in situ; przestrzenna multiomika; farmakologia kondensatów; ukierunkowana degradacja wykraczająca poza system ubikwitynowy. Zagadnienia przekrojowe: powtarzalność badań i standardy raportowania wysokoprzepustowych danych RNA, problem przenikania danych testowych do zbiorów treningowych w predykcji obliczeniowej, bezpieczeństwo biologiczne i problematyka podwójnego zastosowania oraz otwarte dane i zasady FAIR. Prezentacje projektów studenckich.
Koordynatorzy przedmiotu
Rodzaj przedmiotu
Tryb prowadzenia
Założenia (opisowo)
Efekty uczenia się
Wiedza – student zna i rozumie:
1. strukturalne, chemiczne i termodynamiczne zasady warunkujące fałdowanie, dynamikę oraz heterogeniczność konformacyjną RNA;
2. procesy ko- i potranskrypcyjne kształtujące cząsteczki RNA, w tym tworzenie kapu, modyfikacje epitranskryptomiczne, edycję RNA oraz jego degradację;
3. mechanizmy fałdowania białek, kontroli ich jakości, transportu wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego oraz regulowanej degradacji z udziałem układu ubikwityna–proteasom i autofagii;
4. mechanizmy regulacji ekspresji genów i obrony gospodarza związane z białkami wiążącymi RNA, lokalizacją mRNA oraz rozpoznawaniem RNA przez mechanizmy odporności wrodzonej;
5. główne metody eksperymentalne i obliczeniowe wykorzystywane do badania struktury, dynamiki i oddziaływań RNA oraz białek;
6. związki pomiędzy molekularnymi mechanizmami regulacji RNA i białek a procesami chorobowymi i strategiami terapeutycznymi, w tym szczepionkami mRNA, ukierunkowaną degradacją białek oraz edycją RNA.
Umiejętności – student potrafi:
1. interpretować dane uzyskane z wykorzystaniem cryo-EM, CLIP-seq, sondowania chemicznego SHAPE/DMS, znakowania typu pulse-chase oraz obrazowania pojedynczych cząsteczek;
2. porównywać zalety, ograniczenia oraz potencjalne artefakty metod eksperymentalnych i obliczeniowych stosowanych w badaniach RNA i białek;
3. integrować dane strukturalne, biochemiczne, obrazowe i obliczeniowe w celu oceny mechanizmów molekularnych;
4. oceniać możliwości wykorzystania wyników badań eksperymentalnych w opracowywaniu i optymalizacji terapii opartych na RNA i białkach.
Kompetencje społeczne – student jest gotów do:
1. krytycznej oceny dowodów naukowych dotyczących struktury, dynamiki i oddziaływań RNA oraz białek;
2. stosowania wysokich standardów powtarzalności, dokumentowania i raportowania podczas oceny badań z zakresu molekularnych nauk o życiu;
3. rozpoznawania i właściwego uwzględniania zagadnień związanych z bezpieczeństwem biologicznym, etyką oraz podwójnym zastosowaniem badań nad RNA, białkami i powiązanymi technologiami;
4. jasnego, rzetelnego i odpowiedzialnego komunikowania interpretacji naukowych w środowisku akademickim i badawczym.
Kryteria oceniania
Egzamin ma formę testu wielokrotnego wyboru obejmującego materiał przedstawiony podczas wykładów. Trwa maksymalnie 90 minut i składa się z maksymalnie 30 pytań lub zadań, ocenianych indywidualnie, za które można uzyskać łącznie maksymalnie 100 punktów.
Ocena końcowa ustalana jest na podstawie procentu punktów uzyskanych w stosunku do maksymalnej liczby punktów:
do 50% – niedostateczny (2,0),
51–60% – dostateczny (3,0),
61–70% – dostateczny plus (3,5),
71–80% – dobry (4,0),
81–90% – dobry plus (4,5),
91–100% – bardzo dobry (5,0).
Do zaliczenia przedmiotu wymagane jest uzyskanie co najmniej 51% maksymalnej liczby punktów.
Dopuszczalne są maksymalnie 2 nieobecności.
Literatura
Literatura zalecana – literatura obowiązkowa zostanie wskazana przez prowadzących w trakcie zajęć
1. Ganser LR, Kelly ML, Herschlag D, Al-Hashimi HM. The roles of structural dynamics in the cellular functions of RNAs. *Nat Rev Mol Cell Biol.* 2019;20(8):474–489. doi:10.1038/s41580-019-0136-0. PMID: 31182864.
2. Mortimer SA, Kidwell MA, Doudna JA. Insights into RNA structure and function from genome-wide studies. *Nat Rev Genet.* 2014;15(7):469–479. doi:10.1038/nrg3681. PMID: 24821474.
3. Ramanathan A, Robb GB, Chan SH. mRNA capping: biological functions and applications. *Nucleic Acids Res.* 2016;44(16):7511–7526. doi:10.1093/nar/gkw551. PMID: 27317694.
4. Topisirovic I, Svitkin YV, Sonenberg N, Shatkin AJ. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. *Wiley Interdiscip Rev RNA.* 2011;2(2):277–298. doi:10.1002/wrna.52. PMID: 21957010.
5. Garneau NL, Wilusz J, Wilusz CJ. The highways and byways of mRNA decay. *Nat Rev Mol Cell Biol.* 2007;8(2):113–126. doi:10.1038/nrm2104. PMID: 17245413.
6. Schoenberg DR, Maquat LE. Regulation of cytoplasmic mRNA decay. *Nat Rev Genet.* 2012;13(4):246–259. doi:10.1038/nrg3160. PMID: 22392217.
7. Roundtree IA, Evans ME, Pan T, He C. Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. *Cell.* 2017;169(7):1187–1200. doi:10.1016/j.cell.2017.05.045. PMID: 28622506.
8. Nishikura K. Functions and regulation of RNA editing by ADAR deaminases. *Annu Rev Biochem.* 2010;79:321–349. doi:10.1146/annurev-biochem-060208-105251. PMID: 20192758.
9. Balchin D, Hayer-Hartl M, Hartl FU. In vivo aspects of protein folding and quality control. *Science.* 2016;353(6294):aac4354. doi:10.1126/science.aac4354. PMID: 27365453.
10. Kim YE, Hipp MS, Bracher A, Hayer-Hartl M, Hartl FU. Molecular chaperone functions in protein folding and proteostasis. *Annu Rev Biochem.* 2013;82:323–355. doi:10.1146/annurev-biochem-060208-092442. PMID: 23746257.
11. Rapoport TA. Protein translocation across the eukaryotic endoplasmic reticulum and bacterial plasma membranes. *Nature.* 2007;450(7170):663–669. doi:10.1038/nature06384. PMID: 18046402.
12. Zanetti G, Pahuja KB, Studer S, Shim S, Schekman R. COPII and the regulation of protein sorting in mammals. *Nat Cell Biol.* 2011;14(1):20–28. doi:10.1038/ncb2390. PMID: 22193160.
13. Komander D, Rape M. The ubiquitin code. *Annu Rev Biochem.* 2012;81:203–229. doi:10.1146/annurev-biochem-060310-170328. PMID: 22524316.
14. Burslem GM, Crews CM. Proteolysis-targeting chimeras as therapeutics and tools for biological discovery. *Cell.* 2020;181(1):102–114. doi:10.1016/j.cell.2019.11.031. PMID: 31955850.
15. Martin KC, Ephrussi A. mRNA localization: gene expression in the spatial dimension. *Cell.* 2009;136(4):719–730. doi:10.1016/j.cell.2009.01.044. PMID: 19239891.
16. Das S, Vera M, Gandin V, Singer RH, Tutucci E. Intracellular mRNA transport and localized translation. *Nat Rev Mol Cell Biol.* 2021;22(7):483–504. doi:10.1038/s41580-021-00356-8. PMID: 33837370.
17. Hentze MW, Castello A, Schwarzl T, Preiss T. A brave new world of RNA-binding proteins. *Nat Rev Mol Cell Biol.* 2018;19(5):327–341. doi:10.1038/nrm.2017.130. PMID: 29339797.
18. Gerstberger S, Hafner M, Tuschl T. A census of human RNA-binding proteins. *Nat Rev Genet.* 2014;15(12):829–845. doi:10.1038/nrg3813. PMID: 25365966.
19. V'kovski P, Kratzel A, Steiner S, Stalder H, Thiel V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. *Nat Rev Microbiol.* 2021;19(3):155–170. doi:10.1038/s41579-020-00468-6. PMID: 33116300.
20. Hur S. Double-stranded RNA sensors and modulators in innate immunity. *Annu Rev Immunol.* 2019;37:349–375. doi:10.1146/annurev-immunol-042718-041356. PMID: 30673536.
21. Mookherjee N, Anderson MA, Haagsman HP, Davidson DJ. Antimicrobial host defence peptides: functions and clinical potential. *Nat Rev Drug Discov.* 2020;19(5):311–332. doi:10.1038/s41573-019-0058-8. PMID: 32107480.
22. Hancock RE, Sahl HG. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. *Nat Biotechnol.* 2006;24(12):1551–1557. doi:10.1038/nbt1267. PMID: 17160061.
23. Jumper J, Evans R, Pritzel A, et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. *Nature.* 2021;596(7873):583–589. doi:10.1038/s41586-021-03819-2. PMID: 34265844.
24. Winkle M, El-Daly SM, Fabbri M, Calin GA. Noncoding RNA therapeutics — challenges and potential solutions. *Nat Rev Drug Discov.* 2021;20(8):629–651. doi:10.1038/s41573-021-00219-z. PMID: 34145432.
Literatura uzupełniająca (nieobowiązkowa, nieobjęta zakresem egzaminu):
Zaccara S, Ries RJ, Jaffrey SR. Reading, writing and erasing mRNA methylation. *Nat Rev Mol Cell Biol.* 2019;20(10):608–624. doi:10.1038/s41580-019-0168-5. PMID: 31520073.
Knowles TPJ, Vendruscolo M, Dobson CM. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. *Nat Rev Mol Cell Biol.* 2014;15(6):384–396. doi:10.1038/nrm3810. PMID: 24854788.
Parker R, Sheth U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. *Mol Cell.* 2007;25(5):635–646. doi:10.1016/j.molcel.2007.02.011. PMID: 17349952.
Castello A, Fischer B, Eichelbaum K, et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. *Cell.* 2012;149(6):1393–1406. doi:10.1016/j.cell.2012.04.031. PMID: 22658674.
Schoggins JW. Interferon-stimulated genes: what do they all do? *Annu Rev Virol.* 2019;6(1):567–584. doi:10.1146/annurev-virology-092818-015756. PMID: 31283436.
Muttenthaler M, King GF, Adams DJ, Alewood PF. Trends in peptide drug discovery. *Nat Rev Drug Discov.* 2021;20(4):309–325. doi:10.1038/s41573-020-00135-8. PMID: 33536635.