Molekularne techniki analizy RNA 1400-225ZMTA
Wykłady:
1. „Świat RNA” cz. 1.
Koncepcja „RNA world”. Nagrody Nobla w dziedzinie RNA. Katalityczne cząsteczki RNA – klasy, mechanizm, występowanie. SELEX. Pozostałości świata RNA - rybosom, splajsosom, wirusy RNA. Różnorodność klas RNA u Eukaryota i ich metabolizm. Podstawowe mechanizmy regulacji ekspresji genów od transkrypcji do translacji. Procesy alternatywne. Mechanizmy kontroli jakości RNA. Struktury rybonukleoproteinowe, kondensaty komórkowe.
2. „Świat RNA” cz. 2.
3. „Przegląd technik opartych o odwrotną transkrypcję. Techniki badania transkrypcji: TRO, ChIP, RIP i DIP. Analiza końców poliA RNA”.
Teoria odwrotnej transkrypcji (RT). Przegląd technik opartych o RT: RT-PCR w tym półilościowy, pulsacyjny RT-PCR, RACE, cRT-PCR, technika wydłużania startera ("primer extension"). Techniki badania nowopowstajacych transkryptów: jądrowy „Transcription Run-On“, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), immunoprecypitacja RNA (RiP). Do zilustrowania powyższych techniki posłużą badania terminacji transkrypcji Polimerazy I RNA. Specyficzność wiązania DNA przez czynniki transkrypcyjne: „ChIP on chip“, immunoprecypitacja DNA (DIP). Badanie końców poliA RNA (technika PASE, izolacja frakcji RNA poliA+).
4. „Niekodujące RNA”.
Niekodujące RNA (ang. non-coding RNA; ncRNA). Biogeneza i funkcje małych i długich niekodujących RNA. Mechanizmy wyciszania transkrypcji zależne od niekodujących RNA. Kompleksy RNP biorące udział w wyciszaniu transkrypcji. Rola chromatyny w regulacji ekspresji genów.
5. „Świat RNA” cz. 3.
6. „PCR w czasie rzeczywistym (ilościowy; qPCR)”.
Teoria qPCR: sposoby detekcji DNA, podstawy projektowania starterów, sondy hybrydyzacyjne, wprowadzenie do obliczeń. Zastosowania: określanie poziomu badanych transkryptów w komórce, wykrywanie kwasów nukleinowych patogenów, detekcja pojedynczych mutacji (SNP). Dobra praktyka laboratoryjna przy doświadczeniach qPCR i najczęstsze „pułapki czekające” na eksperymentatorów.
7. „RNA w neuronach“.
Transport mRNA do wypustek komórek nerwowych i lokalna translacja w odpowiedzi na pobudzenie synaptyczne. Metody wizualizacji mRNA z żywym neuronie w czasie rzeczywistym, hybrydyzacja in situ, metody biochemiczne pozwalające na bezpośrednią detekcję transkryptów ulegających lokalnej translacji w neuronach.
8. „Udział metabolizmu RNA w procesach fizjologicznych”.
Czynniki metabolizmu RNA i miRNA u roślin – rola w przekazywaniu sygnałów hormonalnych, rozwoju embrionalnym i generatywnym, zegarze dobowym, odporności na stres i patogeny.
9. „Badanie enzymów metabolizmu RNA na przykładzie egzosomu”.
Ścieżki rozkładu RNA w organizmach eukariotycznych. Egzo- i endo- nukleazy. Egzosom: wielofunkcyjny i wieloskładnikowy kompleks. Badania strukturalne i funkcjonalne egzosomu u drożdży i w komórkach ludzkich. Mechanizm działania, współpraca aktywności egzo- i endo-nukleolitycznej.
10. „Struktura RNA a funkcja. Mapowanie struktury RNA in vitro. Metody badania transkryptomów”.
Mapowanie struktury RNA in vitro: sondy molekularne trawiące specyficznie względem struktury i sekwencji RNA. Przełączniki RNA i aptamery – naturalne oraz wyselekcjonowane na potrzeby leków lub biosensorów. Wysokoprzepustowe metody badania transkryptomów oparte o techniki sekwencjonowania nowej generacji (RNA-seq, ChIP-seq).
11. „Metody badań strukturalnych RNA”.
Metody badania struktur kompleksów RNA-białko, metody krystalizacji kompleksów RNP (na przykładzie rybosomu, snRNP, RNazy H). Porównanie krystalografii i badań NMR dla RNA. Technika SAXS. Chemiczne (SHAPE) i bioinformatyczne przewidywanie struktur RNA. Technika mikroskopii elektronowej w niskich temperaturach (Cryo-EM).
12. „Globalne analizy kompleksów rybonukleoproteinowych“ cz. 1.
Metody biochemiczne czyszczenia kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP). Chromatografia RNA i metody wysokoprzepustowe kompleksów RNP połączone z sekwencjonowaniem RNA NGS i spektrometrią mas. Analizy transkryptomu, translatomu i proteomu. Wysokoprzepustowe badania chromatyny, struktury RNA i oddziaływań RNA-RNA, RNA-DNA i RNA-białko. Metody wizualizacji pojedynczych cząsteczek RNA, transkrypcji i translacji w żywych komórkach. Analiza kompleksów RNP w komórkach metodami znakowania zbliżeniowego.
13. „Globalne analizy kompleksów rybonukleoproteinowych“ cz. 2.
Część wykładów będzie prowadzona przez zaproszonych gości.
Ćwiczenia:
1. Podstawy pracy z RNA. Izolacja RNA z drożdży i z roślin.
2. Ocena jakości RNA. Rozdział w żelach. Radioizotopowe i fluorescencyjne metody detekcji RNA. Detekcja miRNA u roślin - wprowadzenie. Detekcja miRNA u roślin, technika Northern-blot (1) z rozdziałem RNA w żelu poliakrylamidowym.
3. Technika Northern-blot (1): hybrydyzacja z sondą oligonukleotydową znakowaną biotyną. Płukania, skan i analiza wyników. Wykrywanie transkryptów CUT u drożdży: technika Northern-blot (2) z rozdziałem RNA w żelu agarozowym.
4. Detekcja CUT u drożdży: znakowanie sondy metodą "asymetryczny PCR" i hybrydyzacja. Analiza obrazu w nauce.
5. Detekcja CUT u drożdży: omówienie wyników hybrydyzacji Northern-blot (2). Analiza końców 3' małych jąderkowych RNA (snoRNA) przy pomocy cRT-PCR. Cięcie Rnazą H dupleksów RNA-oligonukleotyd i ligacja (cyrkularyzacja) RNA.
6. Analiza końców 3' snoRNA: RT + PCR.
7. cRT-PCR: rozdział produktów w żelu i omówienie ich sekwencjonowania. Wykrywanie mRNA metodą RT-qPCR. Projektowanie starterów do qPCR - teoria i praktyka. Konkurs na najwydajniejszą parę starterów, tzn. każdy student zaprojektuje przynajmniej 1 parę starterów, która zostanie zamówiona i przetestowana na następnych zajęciach.
8. Przeprowadzenie reakcji qPCR: testowanie zaprojektowanych starterów dla wybranych genów.
9. Analiza wyników reakcji qPCR. Eksploracyjna analiza danych transkryptomicznych - wprowadzenie.
10. Oznaczenia biochemiczne aktywności enzymów degradujących RNA. Analiza aktywności rybonukleolitycznych różnych wersji białka Dis3 - głównej podjednostki katalitycznej kompleksu egzosomu; badanie wrażliwości aktywności egzorybonukleolitycznej 5'-3' białka Xrn1 na status fosforylacji końca 5' substratu; reakcje degradacji syntetycznych oligonukleotydów RNA znakowanych fluorescencyjnie, rozdział produktów reakcji w denaturującym żelu poliakryloamidowym.
11. Eksploracyjna analiza danych transkryptomicznych i translatomicznych pochodzących z eksperymentów opartych na RNA-seq - ćwiczenia bioinformatyczne.
12. EMSA. Oddziaływania białka - kwasy nukleinowe. Wiązania drożdżowego białka Nsi1 z rDNA. Fluorescencyjny "gel-shift" (inkubacja prób, rozdział w natywnym żelu poliakrylamidowym, skan).
13. Prezentacje studentów na zaliczenie ćwiczeń.
Kierunek podstawowy MISMaP
biotechnologia
Rodzaj przedmiotu
nieobowiązkowe
Tryb prowadzenia
Założenia (lista przedmiotów)
Założenia (opisowo)
Koordynatorzy przedmiotu
Efekty kształcenia
Ma wiedzę na temat metabolizmu RNA u Eukariota.
Zna etapy ekspresji różnych klas RNA, ze szczególnym naciskiem na procesy współ- i po-transkrypcyjne, potrafi podać przykłady oddziaływań RNA - białko oraz zaangażowania cząsteczek RNA w procesy fizjologiczne.
Ma wiedzę dotyczącą enzymów modyfikujących RNA.
Posiada wiedzę teoretyczną i praktyczną pozwalającą na interpretowanie zjawisk i procesów związanych z metabolizmem RNA w oparciu o wyniki doświadczalne.
Samodzielnie planuje i przeprowadza podstawowe typy doświadczeń.
Zna słownictwo dot. metabolizmu RNA zarówno w jęz. polskim jak i angielskim, potrafi komunikować się i podejmować dyskusję na tematy związane z metabolizmem RNA.
Zna teoretyczne podstawy technik molekularnych wykorzystywanych do badania RNA, w stopniu pozwalającym na zrozumienie publikacji naukowych z tej dziedziny.
Potrafi krytycznie analizować otrzymane dane i je rzetelnie prezentować, co przyczynia się do podtrzymywania etosu zawodowego i rozwija zasady etyki zawodowej.
Językowe efekty uczenia się:
Wykorzystuje w sposób biegły naukowe i popularnonaukowe teksty biologiczne w języku ojczystym i angielskim oraz komunikuje się w języku angielskim na poziomie B2+ (K_U03 Bi2).
Posiada umiejętność przygotowania i wygłoszenia wystąpień ustnych w języku polskim i angielskim, zgodnie z wymaganiami określonymi dla poziomu B2+ (K_U11 Bi2).
Wykazuje umiejętność posługiwania się językiem nowożytnym (angielskim) w stopniu umożliwiającym korzystanie z literatury naukowej i komunikację z cudzoziemcami (K_U02 Bt2).
Kryteria oceniania
Warunki zaliczenia ćwiczeń:
- zajęcia zaliczone mogą być jedynie, jeśli student uczestniczył w nie mniej jak 85% zajęć,
- ćwiczenia zaliczane są na ocenę, na którą składają się punkty uzyskane za prezentacje przedstawiane przez studentów, dotyczące publikacji naukowych, w których stosowano techniki badania RNA (waga w końcowej ocenie - 2/3) oraz punkty uzyskane z prac domowych (waga w końcowej ocenie - 1/3),
- temat końcowej prezentacji student wybiera spośród propozycji prowadzących, ewentualnie student sam może zaproponować publikację ale wybór zawsze musi być zatwierdzony przez koordynatora,
- prezentacje w stylu otwartym, tzn. dopuszczamy pytania w trakcie prezentacji ze strony prowadzących jak i pozostałych uczestników kursu.
Warunki egzaminu końcowego z całego przedmiotu:
- przedmiot zaliczany jest na ocenę,
- do egzaminu może przystąpić jedynie student, który zaliczył ćwiczenia,
- egzamin testowy: test jednokrotnego wyboru (4 warianty odpowiedzi na każde pytanie),
- aby zaliczyć egzamin student musi uzyskać nie mniej niż 50% punktów.
Praktyki zawodowe
Nie są wymagane.
Literatura
Skrypt do zajęć oraz podręczniki „Genomy” T. Brown, „Genetyka molekularna” red. P. Węgleński, „Podstawy biologii molekularnej” L. A. Allison; literatura uzupełniająca: publikacje naukowe (doświadczalne i przeglądowe) wskazane w trakcie zajęć przez prowadzących; „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” J. Sambrook i D. Russel 3-cia edycja lub 4-ta edycja M. R. Green and J. Sambrook.
Uwagi
|
W cyklu 2023Z:
Warunki przyjęcia na zajęcia Pierwszeństwo w przyjmowaniu mają studenci I roku studiów MU w Wymagane przedmioty - dla studentów I roku studiów MU: https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSfQsNM4loBx3w7OxaojhNAbXTrU8Vqaiagx0lQEp68JCaGEMw/viewform?usp=sharing 1. Genetyka z inżynierią genetyczną D” (1400-114GEN); Wymagane jest podanie ocen z powyższych przedmiotów (zaliczenia i egzaminu). Wymagane przedmioty - dla studentów III roku studiów I stopnia (licencjackich): 1. Genetyka z inżynierią genetyczną D (1400-114GEN); Wymagane jest podanie ocen z powyższych przedmiotów (zaliczenia i egzaminu). Informację o ocenie/ocenach i/lub preferencjach grup zajęciowych należy |
Więcej informacji
Dodatkowe informacje (np. o kalendarzu rejestracji, prowadzących zajęcia, lokalizacji i terminach zajęć) mogą być dostępne w serwisie USOSweb: