Biologia molekularna 1400-215BM

Wykład

Struktura DNA. Replikacja DNA w organizmach eukariotycznych. Szczegółowe omówienie budowy i roli fragmentów Okazakich oraz problemu terminacji replikacji DNA. Rola i struktura telomerów. Rodzaje uszkodzeń DNA i mechanizmy ich naprawy. Łączenie końców niehomologicznych oraz rekombinacja homologiczna.
Narzędzia w biologii molekularnej i sekwencjonowanie DNA. Chemiczna synteza oligonukleotydów i metoda PCR. Podstawowe enzymy wykorzystywane w procedurach laboratoryjnych biologii molekularnej. Metody sekwencjonowania genomów: metoda Sangera oraz sekwencjonowanie nowej generacji. Omówienie etapów poznawania genomu człowieka. Wykorzystanie DNA do archiwizacji danych.
Struktura genomów, ich elementy i ewolucja. Pierwsze scharakteryzowane genomy i ich cechy. Przedstawienie hipotez dotyczących ewolucyjnego pochodzenia genów. Najważniejsze elementy strukturalne genów. Organizacja genomów. Elementy transpozycyjne, ich budowa oraz mechanizmy transpozycji.

Przykłady różnych mechanizmów regulacyjnych ekspresji genów u organizmów prokariotycznych na poziomie inicjacji i terminacji transkrypcji (m.in. operon laktozowy, operon arabinozowy, operon tryptofanowy, atenuacja). Regulacja na poziomie (i) post-traskrypcyjnym z udziałem białek i regulatorowego RNA (m.in. ryboregulacja, ryboprzełączniki), (ii) translacji i (iii) post-translacyjnie. Pojęcie operonu, regulonu i modulonu. Globalna regulacja na poziomie komórki (m.in. dwuskładnikowy system regulacyjny) oraz całej populacji (w tym quorum sensing). Replikacja i rekombinacja u bakterii.

Regulacja ekspresji genów u eukariontów, ze szczególnym uwzględnieniem hierarchicznej organizacji chromatyny i przestrzennej architektury jądra komórkowego. Zjawisko separacji faz ciecz-ciecz (LLPS) umożliwiające tworzenie kondensatów transkrypcyjnych zawierających polimerazę II RNA i czynniki regulacyjne. Transkrypcja, w tym inicjacja, elongacja i terminacja prowadzone przez polimerazę II RNA. Rola enhancerów, superenhancerów i czynników transkrypcyjnych w precyzyjnej regulacji genów. Dojrzewanie mRNA, takie jak splicing, poliadenylacja i eksport. Małe RNA (miRNA, siRNA, piRNA) i ich udział w regulacji genów oraz utrzymaniu integralności genomu.

Translacja u eukariontów. Aminokwasy. Właściwości łańcucha polipeptydowego. Struktury drugo-, trzecio- i czwartorzędowe białek. Fałdowanie białek. Chaperony i chaperoniny. Modyfikacje posttranslacyjne białek.

Ćwiczenia
Endonukleazy restrykcyjne i enzymy służące do modyfikacji DNA. Rekombinacja DNA, klonowanie. Metody wprowadzania DNA do komórek bakteryjnych. Przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja bakterii. Wektory plazmidowe. Antybiotyki stosowane w biologii molekularnej. Izolacja DNA plazmidowego, jego elektroforeza, oraz ocena czystości i jakości. Zastosowanie elementów operonu laktozowego Escherichia coli w klonowaniu. Metody selekcji zrekombinowanego DNA, alfa-komplementacja. Represja kataboliczna.
Izolacja rekombinowanego białka enzymatycznego wyrażanego w komórkach bakterii E. coli, metodą chromatografii powinowactwa do immobilizowanego metalu. Ocena jakości otrzymywanych preparatów białkowych: i) oznaczenie aktywności katalitycznej enzymu; ii) analiza czystości preparatu metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS (porównanie różnych metod barwienia żeli: błękitem Coomassie R-250, srebrem i barwnikiem fluorescencyjnym); iii) identyfikacja immunologiczna metodą Western (porównanie różnych metod wizualizacji powstających kompleksów antygen - przeciwciało, zastosowanie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z alkaliczną fosfatazą i peroksydazą z chrzanu oraz różnych metod detekcji, w tym wzmocnionej chemiluminescencji).
Organizmy modyfikowane genetycznie na przykładach roślin transgenicznych – sposób otrzymania i wykorzystanie. Wykonanie transformacji przejściowej roślin tytoniu przez infiltrację liści hodowlą bakterii Agrobacterium tumefaciens, niosącą konstrukt genetyczny z genem markerowym.
Na zajęciach zostaną przedstawione najczęściej stosowane w biologii geny repotrerowe, jak białko zielonej fluorescencji (GFP), lucyferaza, glukouronidaza (GUS), itp. Zostaną omówione także metody badania oddziaływań z zastosowaniem genów reporterowych, jak drożdżowy system dwuhybrydowy, FRET (Föster Resonance Energy Transfer), BiFC (Bimolecular fluorescence complementation). Podczas ćwiczeń przeprowadzone zostanie doświadczenie polegające na przejściowej transformacji roślin i obserwacji ekspresji wprowadzonego genu poprzez obserwację białka zielonej fluorescencji z zastosowaniem mikroskopu fluorescencyjnego. Konstrukty używane podczas ćwiczeń zawierają geny kodujące fuzje translacyjne GFP z białkami występującymi w różnych częściach komórki. Pozwoli to na analizę lokalizacji tych białek. Podczas ćwiczeń zostaną także przeprowadzone obserwacje roślin wyrażających gen glukouronidazy pod kontrolą różnych specyficznych tkankowo promotorów.
Na zajęciach zostanie omówiona technika PCR w czasie rzeczywistym (RealTime PCR), zasady działania, w tym specyficzna i niespecyficzna detekcja kwasów nukleinowych oraz zagadnienia związane z planowaniem eksperymentu takie jak wybór genów referencyjnych oraz projektowanie oligonukleotydów. Przedstawione zostaną warianty metody oraz możliwe zastosowanie.
Metody biologii molekularnej stosowane w analizach mutantów oraz linii transgenicznych Arabidopsis. Genetyka roślin – podejście forward i reverse w pracy z modelową rośliną Arabidopsis thaliana, metody mutagenezy Arabidopsis, badania przesiewowe mutantów oraz mapowanie mutacji punktowych i insercyjnych (m.in. analiza PCR sekwencji polimorficznych w dwóch ekotypach Arabidopsis).