Biotechnologia roślin 1400-115BR

Część praktyczną poprzedzać będzie wprowadzenie teoretyczne.

*) Program ćwiczeń w module pierwszym

Wstęp teoretyczny:

Zastosowanie glonów w biotechnologii - zalety i wady wykorzystania glonów na tle roślin wyższych i w porównaniu do prokariotów w produkcji żywności, biopaliw, farmaceutyków, kosmetyków, wartościowych związków chemicznych, ochronie środowiska. Zalety i wady transformacji genomu jądrowego versus plastydowego (chloroplastów). Metody transformacji glonów: elektroporacja, szok osmotyczny, bombardowanie biolistyczne (strzelba genowa). Markery selekcyjne i metody selekcji uzyskanych linii mutantów glonów, metody weryfikacji wprowadzonej mutacji/ ekspresji transgenu. Metody izolacji DNA z komórek glonów, metody długotrwałego przechowywania komórek glonów.
Część praktyczna:
Ćw. 1. Transformacja krasnorostu C. merolae metodą szoku osmotycznego z wykorzystaniem glikolu polietylowego.
Ćw. 2. Transformacja C. subellipsoidea metodą elektroporacji (elektrotransformacja). Wpływ parametrów napięcia i odległości elektrod w celu określenia praktycznego ich wpływu na wydajność transformacji. Wysianie transformowanych hodowli na podłoże stałe.
Ćw. 3. Transformacja z wykorzystaniem strzelby genowej zielenicy C. subellipsoidea. Wpływ parametrów ciśnienia i odległości na wydajność transformacji. Wysianie transformowanych hodowli na podłoże stałe.
Ćw. 4. Metody izolacja DNA z komórek glonów oraz metody przechowywania długotrwałego przechowywania komórek glonów. Liczenie kolonii. Podsumowanie.

*) Program ćwiczeń w module drugim:

Część teoretyczna:

Selekcja nowych odmian roślin na podstawie analizy markerów molekularnych, metody analizy polimorfizmów odpowiedzialnych za naturalną zmienność cech ważnych z punku widzenia użytkowego (GWAS, genome-wide association studies). Konstrukcja roślin transgenicznych oraz edytowanie genomów roślinnych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Zastosowanie roślin transgenicznych oraz odmian otrzymanych metodą CRISPR/Cas9. Biologia chemiczna i jej zastosowania w biotechnologii roślin - działanie klasycznych regulatorów wzrostu roślin takich jak hormony roślinne lub ich inhibitory, a także procesy służące opracowaniu nowych regulatorów, m.in. badania przesiewowe bibliotek cząsteczek chemicznych oraz projektowanie celowanych inhibitorów białek; wykorzystanie linii Arabidopsis wyrażających gen reporterowy do analizy aktywności badanych inhibitorów.

Część praktyczna:

Ćw. 1. Porównanie linii Arabidopsis z mutacją inercyjną oraz delecją wygenerowaną metodą CRISPR/Cas9. Charakterystyka badanych linii za pomocą genotypowania transgenu T-DNA oraz delecji CRISPR, badania poziomu ekspresji wybranych genów, badania poziomu białka za pomocą western-blot.

Ćw. 2. Analiza działania chemicznych regulatorów wzrostu. Klasyczne regulatory wzrostu - gibereliny oraz inhibitory biosyntezy giberelin. Analiza fenotypów mutantów Arabidopsis niezdolnych do biosyntezy giberelin oraz posiadających hiperaktywną ścieżkę sygnalizacji tego hormonu. Demonstracja screen`u fenotypowego na działanie nowych cząsteczek chemicznych - potencjalnych regulatorów wzrostu

*)Program ćwiczeń w module trzecim:

Wstęp teoretyczny:

Zastosowani transgenicznych roślin wyższych w biotechnologii i nauce. Plazmidy używane do transformacji roślin wyższych oraz metody otrzymywania pożądanych konstrukcji genowych.Metody transformacji roślin wyższych, szczegółowe omówienie metod wykorzystujących bakterię Agrobacterium tumefaciens. Zasady wyprowadzania niezależnych linii transgenicznych i ich analizy.

Część praktyczna

Ćw. 1: (a) Konstrukcja plazmidu do transformacji roślin z wykorzystaniem rekombinacji DNA (system Gateway). (b) Transformacja E.coliproduktem reakcji rekombinjacji. (c)
Transformacja stabilna tytoniu przy użyciu bakteriiAgrobacteriumtumefaciens zawierającym wybrane konstrukty – inkubacja eksplantatów z bakteriami.

Ćw. 2:(a) PCR kolonijny na koloniach E. coliotrzymanych po transformacji konstruktem otrzymanym w "systemie Gateway" (kontynuacja ćw. 1a i 1b). (b) Porównanie fenotypu wybranych linii transgenicznych będących w posiadaniu zakładu z roślinami nietransgenicznymi – rozpoczęcie uprawy w warunkach różnicujących fenotyp.

Ćw. 3:(a) Wyprowadzanie roślin transgenicznych - pasaż eksplantatów na świeżą pożywkę (kontynuacja ćw. 1c). (b) Analiza produktów PCR kolonijnego(kontynuacja ćw. 2a). (c) Porównanie fenotypu wybranych linii transgenicznych z roślinami nietransgenicznymi – analiza różnic (kontynuacja ćw. 2b). (d) Izolacja RNA z roślin poddanych analizie fenotypowej (syntezęcDNA wykonają prowadzący poza zajęciami)

Ćw. 4: (a) Analiza tkankowo-specyficznej aktywność promotora przy użyciu genu reporterowego GUS – jako przykład roślin wykorzystywanych w badaniach naukowych. (b) Analiza różnic w ekspresji wybranych endogenów pomiędzy roślinami transgenicznymi i nietransgenicznymi z wykorzystaniem reakcjiPCR w czasie rzeczywistym (kontynuacja ćw. 3d).

Ćw. 5: (a) Wyprowadzanie roślin transgenicznych - pasaż eksplantatów/regeneranów na świeżą pożywkę z pobraniem tkanki do dalszych analiz molekularnych (kontynuacja ćw. 3a). (b) Analiza obecności transgenu w uzyskanych regenerantach - izolacja DNA z pobranych fragmentów regenerantów (reakcję PCR wykonają prowadzący poza zajęciami). (c) Test segregacji transgenu - wysianie nasion różnych linii transgenicznych na pożywkę z czynnikiem selekcyjnym.

Ćw. 6:(a) Analiza obecności transgenu w uzyskanych regenerantach – żel z wynikami PCR (kontynuacja ćw. 5b). (b) Wyniki testu segregacji transgenu (kontynuacja ćw. 5c). (c) Omówienie wyników analizy różnic w ekspresji endogenów pomiędzy roślinami transgenicznymi a nietransgenicznymi (kontynuacja ćw. 4d), (d) Analiza tkankowo-specyficznej aktywność promotora przy użyciu genu reporterowego GUS - omówienie wyników reakcji barwnej (kontynuacja ćw. 4a).