Mechanizmy nowotworzenia i nowoczesne terapie przeciwnowotworowe 1400-217MNiTP

Wykład:
Epidemiologia nowotworów. Czynniki sprzyjające powstawaniu chorób nowotworowych: skażenie środowiska, uwarunkowania genetyczne. Charakterystyka komórki nowotworowej. Geny torów mutacyjnych: onkogeny, geny supresorowe, geny stabilizujące i ich rola w kancerogenezie. Mutacyjna teoria kancerogenezy, klasyczne modele: inicjacja, promocja, progresja. Aktywacja metaboliczna i detoksykacja związków egzogennych; polimorfizm genów metabolicznych jako marker wrażliwości na nowotworzenie. Uszkodzenia DNA jako źródło mutacji. Zewnętrzne i wewnętrzne czynniki uszkadzające DNA: promieniowanie UV, jonizujące, środowiskowe kancerogeny chemiczne, dieta, stany zapalne, infekcje, stres oksydacyjny, endogenna metylacja DNA. Mutageneza replikacyjna i transkrypcyjna; rodzina polimeraz o obniżonej wierności - charakterystyka i rola w powstawaniu mutacji i nowotworów. Naprawa DNA: systemy naprawy DNA - odwrócenie uszkodzenia, poreplikacyjna naprawa źle dopasowanych zasad, naprawa przez wycinanie, naprawa rekombinacyjna. Rola białek naprawy DNA w tworzeniu przeciwciał. Nowoczesna teoria kancerogenezy. Zaburzenia w transmisji sygnałów. Cykl komórkowy i rola zaburzeń w przebiegu cyklu komórkowego w kontekście nabywania zdolności do nieograniczonych podziałów. Apoptoza i jej rola w kancerogenezie. Naprawa DNA a sygnalizacja komórkowa. Angiogeneza. Tworzenie nowych naczyń. Drogi przerzutowania. Rozrost nowotworu w nowym miejscu. Zależność od czynników wzrostu i białek adhezyjnych. Przyczyny przerzutowania do określonych organów. Choroby związane z brakiem naprawy DNA: nowotwory (Xeroderma pigmentosum, syndrom Blooma, Ataksja telangiectasia, anemia Fanconiego), choroby rozwojowe i neurodegeneracyjne (syndrom Cockayne'a, Trichotiodystrofia), starzenie (syndrom Wernera). Kancerogeneza wirusowa: wirusy onkogenne (DNA, RNA), wirusy onkogenne człowieka (rak szyjki macicy - HPV 16, 18; białaczki - HTLV 1,2; żółtaczki - HBV, HCV). Epigenetyczna teoria nowotworzenia: metylacja i demetylacja promotorów genów, rola naprawy DNA i białek Tet; acetylacja i metylacja histonów; miRNA. Macierzystopodobne komórki nowotworowe: cechy, markery, potencjalne inhibitory. Współczesna diagnostyka nowotworów. Metody oparte o techniki PCR (PCR, LTR, RT-PCR, QTR-PCR), techniki oparte o działanie enzymów restrykcyjnych. Klasyczne metody terapii nowotworów; radioterapia; chemioterapia; nowoczesna terapia biologiczna; nowe cele terapeutyczne, sprzężona letalność, nowoczesne nośniki leków przeciwnowotworowych.
Wykład obejmuje 30 godz. i jest zakończony egzaminem. Czas poświęcony przygotowaniu do egzaminu jest indywidualny, nie mniejszy niż 30 godz.

Ćwiczenia:
Ćwiczenia – 60 godz. (10 ćwiczeń po 6 godz.)

1. Uszkodzenia DNA jako źródło mutacji i nowotworów; ścieżki naprawy DNA
- indukcja uszkodzeń DNA przez czynniki alkilujące i utleniające na modelu plazmidowego DNA i identyfikacja uszkodzeń enzymami naprawczymi
- indukcja uszkodzeń w komórkach ssaków typu dzikiego i z nieaktywnymi systemami naprawy DNA – badanie przeżywalności (Alamar Blue)
Wtórne uszkodzenia DNA - Modyfikacja jednoniciowego DNA faga M13 dimetylosiarczanem

2. Wtórne uszkodzenia DNA.
- Depurynacja alkilowanych zasad DNA i otwieranie pierścieni imidazolowych; naprawa, właściwości biologiczne

3. Wykorzystanie operonu lac do określania typów mutacji;
-badanie specyficzności mutagennej promieniowania UV, czynników alkilacyjnych i oksydacyjnych przy użyciu szczepów Millera.

4. Testy wykrywania mutagenów środowiskowych
SOS chromotest, pokaz wymian chromatyd siostrzanych
oraz zmian przednowotworowych w jelicie grubym

5. Bezpośrednia naprawa DNA bez naruszenia integralności DNA
Oksydacyjna dealkilacja – białko AlkB; badanie udziału białek AlkB i systemu BER w naprawie etenoadduktów na mutantach E. coli.
6. Polimorfizm genów naprawy DNA jako czynnik ryzyka rozwoju choroby nowotworowej.
Badanie polimorfizmu genów OGG1, OH-1, GST

7. Komórkowe mechanizmy odpowiedzi na uszkodzenia DNA:
- obserwacja blokowania replikacji w komórkach ssaków – technika fiber DNA (film i pokaz preparatów – zliczanie miejsc zatrzymania replikacji)
- odpowiedź komórkowa na uszkodzenia DNA (DDR) – aktywacja szlaku DDR – fosforylacja ATM, ATR, Chk1, histon H2AX (analiza Western, opcjonalnie obserwacja skupisk γH2AX po działaniu odczynnikiem Fentona)
- analiza mniejszościowych mutacji w genach krytycznych (APC, RAS) w raku jelita grubego metodą MSSCP
8. Terapie nowoczesne i eksperymentalne: - indukcja sprzężonej letalności przez inhibitory PARP1 w komórkach typu dzikiego, oraz z mutacjami w różnych systemach naprawy DNA (BER, HR, NHEJ)
9. Terapie skojarzone: Synergistyczne działanie leków (kamptotecyna, TRAIL, inhibitory CK2)
Badanie przeżywalności komórek z ustalonych linii nowotworowych za pomocą standardowo stosowanego testu MTT. Określenie procentu przeżywalności komórek w odpowiedzi na cząsteczki terapeutyczne o różnym mechanizmie działania. Analiza synergistycznego działania badanych cząsteczek.
10. Nowe metody wprowadzania leków do komórki – peptydy penetrujące
Zaopatrzenie rekombinowanego białka w kasetę CPP jest nową metodą stosowaną przy konstrukcji leków, których cel terapeutyczny znajduje się wewnątrz komórki. Ćwiczenie polega na wprowadzeniu do komórek nowotworowych człowieka rekombinowanego białka z dołączoną sekwencją YGRKKRRQRR pochodząca z białka TAT oraz wykrywaniu wprowadzanego białka w komórce.